高效液相色谱法测定黄体酮及有关物质

高效液相色谱法测定黄体酮及有关物质

陈丽萍，周慧，张信，尤兴田

（扬州工业职业技术学院 化学工程学院，江苏 扬州 225127）

摘 要： 采用Agilent 1260色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇-乙腈-水（25∶35∶40）为流动相，流速1.0 mL·min-1，柱温30 ℃，检测波长200 nm，高效液相色谱法测定黄体酮的含量及有关物质。结果表明：黄体酮与氢化物、水化物等杂质分离度良好，黄体酮在0.25 ~ 1 200 μg·mL-1的质量浓度范围内呈良好的线性关系（R2 = 0.999 93，n =7），水解物在0.26 ~ 104 μg·mL-1范围内呈良好的线性关系（R2 = 1.000 0，n = 6），氢化物在 0.26 ~ 105 μg·mL-1的质量浓度范围内呈良好的线性关系 （R2 =1.000 0，n =6），各杂质的控制限度均达到定量限。本法专属性强，方法准确、灵敏，操作简便，可作为黄体酮的质量控制方法。

关 键 词：高效液相色谱法；黄体酮；有关物质

中图分类号：TQ460.7+2 文献标识码： A 文章编号： 1004-0935（2022）05-0730-03

黄体酮是孕激素类药物，生理效应及临床治疗5 μm）；流动相为甲醇-乙腈-水（25∶35∶40）；柱

-1

作用广泛，应用历史悠久。目前，黄体酮在《中国温30 ℃；流速1.0 mL·min；检测波长200 nm；进药典》2015年版二部中已有收载，高效液相色谱法样体积10 μL。 测定其含量与有关物质的检测波长为241 nm [1-2]。1.2.2 标准溶液的配制 鉴于黄体酮在生产中引入的中间体氢化物（5-孕甾取黄体酮对照品约40 mg，精密称定，置20 mL 烯-3β-醇-20-酮3-醋酸酯）和水化物（5-孕甾 容量瓶中，加流动相溶解并稀释至刻度，摇匀，作 烯-3β-醇-20-酮）在药典条件下不能检测，为保证各为黄体酮对照品储备液。精密吸取黄体酮储备液 有关物质快速准确的测定，本文创建了高效液相色1.0 mL，置 100 mL 容量瓶中，加流动相溶解并稀谱法波长200 nm的检测方法，有利于更好地提高黄释至刻度，摇匀，作为黄体酮对照品溶液。 体酮质量和生产的稳定性，该方法未见药典收载，取水解物工作对照品（精制品）约10 mg，精也未见文献报道。 密称定，置100 mL容量瓶中，加稀释液溶解并稀

释至刻度，摇匀，作为氢化物工作对照品储备溶液。

1 实验部分 精密吸取1.0 mL，置 10 mL容量瓶中，加稀释液

溶解并稀释至刻度，摇匀，作为水解物工作对照品1.1 仪器与试药

溶液。 Agilent 1260 高效液相色谱仪（二极管阵列检

取氢化物工作对照品（中间体）约10 mg，精测器）。黄体酮对照品，批号100027-201209，纯度

99.7%，中国药品生物制品鉴定所；黄体酮供试品，密称定，置100 mL容量瓶中, 加稀释液溶解并稀

释至刻度，摇匀，作为氢化物工作对照品储备溶液。批号HT-p201806001，江苏联环药业有限公司；水

精密吸取1.0 mL，置10 mL 容量瓶中，加稀释液解物工作对照品（精制品），批号HT-a20180201，

溶解并稀释至刻度，摇匀，作为氢化物工作对照品AR，上海青析化工科技有限公司；氢化物工作对照

溶液。 品（中间体），批号20180201，国药集团化学试剂

1.2.3 黄体酮碱破坏溶液 有限公司；甲醇、乙腈，色谱纯，天津康科德科技

取本品黄体酮对照品约25 mg，精密称定，置有限公司；水为超纯水。

-1

25 mL容量瓶中，加0.1 mol·L氢氧化钠甲醇溶液1.2 实验方法

-1

10 mL使溶解，置60 ℃水浴4 h，放冷；用1 mol·L1.2.1 色谱条件

盐酸溶液调节至中性，用稀释液稀释至刻度，摇匀。 色谱柱为Kromasill00-5 C18（250 mm×4.6 mm，

基金项目： 2019 年扬州工业职业技术学院校级科研课题（项目编号：2019xjzk016）。

收稿日期： 2021-10-13 作者简介： 陈丽萍（1974-），女，江苏省靖江市人，副教授，博士研究生，2006年毕业于扬州大学物理化学专业，研究方向：药物分析教学和

科研。

第51卷第5期 陈丽萍，等：高效液相色谱法测定黄体酮的含量及有关物质 731

1.2.4 黄体酮系统适用性溶液

精密吸取氢化物、水解物工作对照品储备溶液各1.0 mL，置10 mL容量瓶中，加黄体酮碱破坏溶液稀释至刻度，摇匀，作为黄体酮（粗品）系统适用性溶液。

1.2.5 黄体酮试验溶液

取本品约10 mg，精密称定，置10 mL容量瓶中，加少量稀释液溶解，精密吸取氢化物、水解物工作对照品储备溶液各1.0 mL，加稀释液至刻度，摇匀，作为黄体酮系统适用性溶液。

2 实验结果

2.1 方法学验证 2.1.1 专属性考察

在1.2.1节色谱条件下进样，记录色谱图如图1所示，黄体酮主要杂质分离结果如表1所示。黄体酮在241 nm有吸收，而已知杂质在241 nm无吸收（图1A），在波长200 nm下黄体酮和已知杂质水解物、氢化物以及碱破坏降解杂质有吸收（图1B）。由表1的结果可以看出，黄体酮和已知杂质水解物、氢化物以及碱破坏降解杂质的均可达到有效分离，表明该法的专属性好，可以有效检测黄体酮生产过程中在各苛刻条件下（碱水解）的降解产物及中间产物。

图1 专属性试验色谱图

表1 黄体酮主要杂质分离结果

溶液 时间/min

水解物 黄体酮 黄体酮碱降解物

氢化物 黄体酮 - 12.810 - - 水解物 11.867 - - - 氢化物 - - - 27.135 试验溶液

11.861

12.766

13.708

27.122

2.1.2 线性范围

2.1.2.1 黄体酮的线性范围

分别精密量取黄体酮储备液适量，加稀释溶剂稀释制成1 200、1 000、500、100、50、20、10、5、

2、1、0.5、0.25 μg·mL-1

的溶液，摇匀。按上述色谱系统（1.2.1），将上述标准溶液依次进样，记录峰

面积。以峰面积（A）为纵坐标、浓度（C，μg·mL-1

）为横坐标进行线性回归，得线性回归方程及关系，结果如表2所示。由表2可知，黄体酮（200 nm波

长）在0.25 ~ 1 200 μg·mL-1

的质量浓度范围内呈良

好的线性关系（R2

为1.000 0和0.999 93，n =7）。 2.1.2.2 有关物质的线性范围

分别精密量取适量水解物对照品储备溶液，加稀释溶剂稀释制成100、50、20、10、5、2、1、0.5、

0.25 μg·mL-1

的溶液，摇匀。

分别精密量取适量氢化物工作对照品储备溶液，加稀释溶剂稀释制成100、50、20、10、5、2、

1、0.5、0.25 μg·mL-1

的溶液，摇匀。

按上述色谱系统（1.2.1）将上述标准溶液依次进样，记录峰面积。以峰面积为纵坐标，质量浓度为横坐标进行线性回归，得线性回归方程及相关系

数，结果如表2所示。水解物在0.26 ~ 104 μg·mL

-1

范围内呈良好的线性关系（R2

= 1.000 0，n = 6），氢

化物在 0.26 ~ 105 μg·mL-1

的质量浓度范围内呈良

好的线性关系（R2

=1.000 0，n =6）。

表2 线性关系测定结果

项目 波长/nm 线性回归方程 线性范围/(μg·ml-1

)

相关系数 黄体酮 241 A=28.994 5C+43.05 0.25~1 200 0.999 93 黄体酮 200 A=6.424 5C+1.90 0.25~1 200 1.000 0 水解物 200 A=14.886 8C+0.88 0.26 ~104 1.000 0 氢化物

200

A=12.838 6C+0.12

0.26~105

1.000 0

2.1.3 定量限与检测限

黄体酮、水解物、氢化物定量限溶液：精密吸取黄体酮对照品溶液0.4 mL、水解物工作对照品溶液5.0 mL、氢化物工作对照品溶液6.0 mL，置

732 辽 宁 化 工 2022年5月

100 mL 容量瓶中，加稀释液稀释至刻度，摇匀，作为黄体酮、水解物、氢化物定量限溶液。

黄体酮、水解物、氢化物检测限溶液：精密吸取黄体酮、水解物、氢化物定量限溶液3.0 mL，置10 mL容量瓶中, 加稀释液6.0 mL，摇匀，作为黄体酮、水解物、氢化物检测限溶液

按本法测定，精密量取上述定量限溶液、检测限溶液分别进样10 μL，当信噪比S/N≥10时，作为定量限溶液；当信噪比S/N≥3时，作为检测限溶液。同时取各定量限溶液连续进样6针，记录色谱图。结果表明，黄体酮、水解物和氢化物的定量限

-1

分别为0.040、0.517、0.640 μg·mL，均小于限度质

-1

量浓度（1.0 μg·mL）；检测限质量浓度分别为

-1

0.013、0.172、0.213 μg·mL，均小于限度质量浓度

-1

（0.5 μg·mL）。 2.1.4 精密度试验 2.1.4.1 重复性

取6份样品溶液检测，黄体酮、水解物、氢化物、未知杂质含量的相对标准偏差分别为0.02%、0、7.81%、0.37%，结果表明本方法重复性好。 2.1.4.2 中间精密度

2位操作人员于2天内分别按1.2.2方法配制６份样品溶液进行分析，记录峰面积。2位人员于2天内测得的黄体酮、水解物、氢化物、未知杂质含量的相对标准偏差分别为1.24%、0、0.39%、0.5%，结果表明方法的中间精密度符合可接受标准。 2.1.5 方法耐用性

固定其他色谱条件不变，将上述色谱条件分别

-1

改变流速（0.95、1.05 mL·min）、色谱柱温度（28、32 ℃）后进样，对水解物、黄体酮、碱降解物、氢化物分离度进行考察，实验结果表明，在上述色谱

条件下，黄体酮与3种杂质的分离度好，3种杂质与黄体酮的相对保留时间（RRT）没有显著变化，各组分的含量基本恒定。因此，色谱条件的细微变化对测定结果没有影响。

2.2 样品测定

按 1.2.2方法分别配制混合对照品溶液和样品溶液，按色谱系统1.2.1色谱条件分别进样分析，按外标法计算黄体酮及各已知杂质的含量，其他未知杂质含量按不加校正因子的主成分自身对照法计算。 样品测定结果见表3。

表 3 黄体酮样品的测定结果

批号 201806001 201806002 201806003

纯度/% 98.19 98.08 98.16

水解物/% 0.214 0.226 0.264

氢化物 未知杂质/% 总杂质/% 未检出 未检出 未检出

0.622 0.621 0.625

1.812 1.920 1.844

3 结 论

本文建立了高效液相色谱法200 nm波长下测定黄体酮及有关物质的含量，本方法具有一定专属性、灵敏度、准确性、耐用性，可以作为黄体酮粗品、精制品质量的有效检验、监控。在黄体酮粗品波长200 nm检测试验中，除了已知杂质水解物、氢化物等峰外，还检测出未知杂质峰。杂质分子结构、来源有待进一步分析研究，生产中暂归化法检测监控。

参考文献：

［1］ 国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）[S]．北京: 中国医

药科技出版社， 2015.

［2］ 高娟，唐素芳. 高效液相色谱法测定黄体酮的有关物质[J].中国药

品标准，2010，11（1）：29-32.

［3］张立雯，冉兰，晁若冰. HPLC测定黄体酮中的有关物质[J] . 华西

药学杂志，2006，21（6）：570-572.

Determination of Progesterone and Related Substances

by High Performance Liquid Chromatography

CHEN Li-ping, ZHOU Hui, ZHANG Xin, YOU Xin-tian （School of Chemical Engineering, Yangzhou Polytechnic Institute, Yangzhou Jiangsu 225127, China）

Abstract: High performance liquid chromatography (HPLC) was applied to determine progesterone and related substances. The analysis was carried out on a Agilent 1260 column (250 mm×4.6 mm, 5 μm) with methanol-acetonitrile-water (25∶35∶40) as mobile phase, the flow rate was 1.0 mL·min-1. The detection wavelength was set at 200 nm with the column temperature of 30 ℃. Under the above chromatographic conditions, the separation of progesterone from impurities such as hydride and hydrate were achieved. The linear relationship of the progesterone was in the mass concentration range of 0.25~1 200 μg·mL-1 (R2 = 0.999 93, n =7). The linear relationship of the hydrolysate was in the range of 0.26~104 μg·mL-1 (R2 =1.000 0, n =6), and the linear relationship of the hydride was in the range of 0.26~105 μg·mL-1 (R2 =1.000 0, n =6). The method can be used as a quality control method for progesterone. Key words: High performance liquid chromatography; Progesterone; Related substances